יצירת תאי נוק אאוט, בהם אחד מהגנים אינו מתפקד, היא שיטה נפוצה במחקר הביולוגי. אך מחקר חדש גילה שלתאים יש דרכים יצירתיות להתגבר על המוטציה ולהשיב את הגן לפעילות חלקית

בסרט "פארק היורה", שעלה למסכים בשנת 1993, המתמטיקאי איאן מלקולם, בגילומו של ג'ף גולדבלום, אומר את המשפט הזכור "Life finds a way” – החיים מוצאים להם דרך. זאת בעקבות הגילוי שהחיות בפארק, שהיו אמורות להיות ממין נקבה בלבד, הצליחו להתרבות. ואכן, לביולוגיה יש דרכים רבות להתגבר על מכשולים.

לתאים שלנו, לדוגמה, יש מנגנונים רבים שמיועדים למנוע היווצרות חלבונים פגומים וקצרים מדי. החומר התורשתי שלנו, ה-DNA, כולל גנים ובהם הוראות ליצירת חלבונים; ההוראות האלה כתובות כשורה של קודונים בני שלוש אותיות. מן ה-DNA, ההוראות האלו מועתקות למולקולה אחרת שנקראת RNA-שליח. מבנים חלבוניים הנקראים ריבוזומים "קוראים" את הקודונים של ה-RNA-שליח ובונים לפיהם את החלבון. מוטציה (שינוי ב-DNA) מהסוג הנקרא "הסטת מסגרת" (frameshift mutation) משנה את מסגרת הקריאה של הקודונים וכך גורמת ליצירת חלבון אחר.

לדוגמה, השוו את המשפט "כלב קטן כאן קפץ לשם", המורכב כמו הגנים ממילים בנות שלוש אותיות, למשפט שבו שונתה מסגרת הקריאה על ידי הכנסת אות אחת לאחר האות כ': "כלל בקט ןכא ןקפ ץלש ם". המילים שבמשפט השתנו לחלוטין. כאשר שינוי כזה קורה ב-DNA, הוא גורם במקרים רבים להופעה של קודון "סיום"' כלומר שלוש האותיות שמסמנות לתא להפסיק לייצר את החלבון, בתחילת הגן או באמצעו במקום בסופו. כך עשוי להיווצר חלבון קצר, שלא יהיה פעיל ועלול אפילו להזיק לתא. מוטציה כזו נקראת מוטציית נונסנס (nonsense mutation, כלומר, מילולית, מוטציה חסרת משמעות). ביצורים איקריוטיים קיים מנגנון הנקרא "פירוק RNA נונסנס" (nonsense mediated decay), ובקיצור NMD, שמיועד לפרק מולקולות RNA-שליח שמכילות קודון "סיום" שלא במקומו.

אילוסטרציה של מוטצית הסטת מסגרת | Adapted from Campbell NA (ed.) Biology, 1990
אילוסטרציה של רצף ה-DNA והחלבון לפני (למעלה) ואחרי מוטצית הסטת מסגרת |  Campbell NA (ed.) Biology, 1990

עדיין כאן, למרות הכל

ביולוגים מנצלים את המנגנון הזה כדי לבצע נוק אאוט (knock-out) של גן לחלבון מסוים - כלומר למנוע את התבטאותו. אז הם בודקים איזו תכונה או יכולת אבדה לתא, וכך לומדים מהם התפקידים שאותו חלבון מבצע. בחיידקים, או ביצורים איקריוטיים פשוטים כמו שמרים, נהוג לבצע מחיקה כוללת של הגן – כלומר הגן כולו מוּצָא מתוך ה-DNA, וכך אין ספק שגם החלבון שאותו גן מקודד אינו נמצא בתאים. אולם ביצורים איקריוטיים מורכבים יותר, ובייחוד בתאי יונקים כמו עכבר ואדם שמשמשים במחקר ביו-רפואי, בדרך כלל אי-אפשר לסלק את הגנים לחלוטין, פשוט כי הם ארוכים מדי. עד לפני שנים אחדות, יצירת תאי knock-out אנושיים הייתה עבודה קשה ומייגעת, אך גילוי מערכת קריספר לעריכה גנטית אפשֵר לעשות זאת בקלות יחסית בכל סוג תא ובעבור כל גן. השימוש הנפוץ ביותר בקריספר הוא יצירת מחיקות קטנות בתחילת הגן או באמצעו, אשר יוצרות מוטציית nonsense, מתוך מחשבה שמנגנון ה-NMD כבר יעשה בשבילנו את שאר העבודה. בדרך כלל, זה אכן קורה. לכן ישנם חוקרים המוודאים שהמוטציה אכן קיימת ב-DNA, אך אינם עורכים בדיקה נוספת כדי לוודא שהחלבון, או חלק ממנו, אכן לא נמצא בתא.

וולפגנג הובר (Huber) וחברי קבוצתו מהמעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית (EMBL) בהיידלברג, גרמניה, החליטו לערוך בדיקה שיטתית של כ-200 תאי נוק אאוט לכ-130 גנים שונים – לכמה מהגנים היו כמה תאי נוק אאוט נפרדים– ולבדוק אם בתאים אלה עדיין ניתן למצוא שאריות של ה-RNA-השליח או של החלבון. התוצאות המפתיעות של המחקר פורסמו בכתב העת Nature Methods (גרסה מוקדמת יותר של המאמר, הפתוחה לקריאה ללא צורך במנוי, הועלתה לשרת bioRxiv).

תחילה בדקו החוקרים אם ה-RNA-השליח עובר פירוק על ידי מנגנון ה-NMD. הם שיערו שברוב התאים רמת ה-RNA תהיה קרובה לאפס, אך להפתעתם, ה-RNA הכולל קודון סיום במָקום מוקדם מדי הגיע לרמה קרובה לאפס רק ב-20 אחוז מהמקרים. ברוב המכריע של התאים רמת ה-RNA הייתה גבוהה מאפס, ולפעמים אפילו גבוהה מהרגיל - בטווח שבין עשירית מהרמה הנורמלית ועד לפי שניים(!) ממנה. כלומר, בכל תא נוק-אאוט מנגנון ה-NMD עבד ביעילות שונה, ולעתים הוא לא עבד כלל. ממצא זה משתלב עם ממצאים של מחקרים אחרים, שמראים שאנו עדיין רחוקים מלהבין כיאות את החוקיות של פעולת מנגנון ה-NMD.

בהמשך בדקו החוקרים אם החלבונים, תוצרי אותם גנים, עדיין נמצאים בתאים. החוקרים הופתעו שוב לגלות שבשליש מתאי הנוק אאוט שנבדקו נמצאו החלבונים, ברמות שבין 10 אחוזים ל-100 אחוזים מהרמה הנורמלית.

קפיצות ודילוגים

כדי לבדוק איך זה קרה, הובר וקבוצתו התעמקו בכמה מקרים שבהם נמצאו חלבונים. הבדיקות העלו שתי שיטות שונות של התאים להתגבר על המוטציה ולייצר בכל זאת את החלבונים מהגנים שעברו נוק אאוט. מנגנון אחד נקרא "התחלת תרגום מחודשת". כאשר ריבוזום מתחיל לתרגם RNA-שליח, הוא תמיד מתחיל מקודון לחומצה האמינית מתיונין. ואולם, מתיונין יכולה להופיע גם בהמשך החלבון. במנגנון "התחלת תרגום מחודשת", הריבוזום מתחיל את התרגום במתיונין השני (או השלישי) במקום בראשון. אם נחזור לדוגמה מלמעלה, במקום "כלל בקט ןכא ןקפ ץלש ם" נקבל "כאן קפץ לשם" (קפצנו ל-כ' השנייה והמשכנו לקרוא בשלשות). החלבון המתקבל קצר יותר, אך הוא חוזר למסגרת הקריאה המקורית, ולכן כולל את רוב המלים המקוריות - כך שהוא עדיין עשוי להיות בעל פעילות ביולוגית. החוקרים מצאו, למשל, שהתחלת תרגום מחודשת כזו אירעה בתאים שבוצע בהם נוק אאוט לגן בשם BRD4. כתוצאה מכך התקבל חלבון קצר ב-40 אחוזים מהחלבון השלם, ששמר על חלק מפעילותו הנורמלית. במקרה של תאי נוק אאוט לגן בשם DNMT1, החוקרים מצאו שנוצרו שני חצאים של החלבון. חצי חלבון אחד כלל את הרצף מהמתיונין הראשון ועד למיקום המוטציה שיצרה קודון "סיום", והחצי האחר תורגם כנראה החל ממתיונין שנמצא אחרי קודון ה"סיום" שיצרה המוטציה, ועד לקודון ה"סיום" הנורמלי. במקרה זה פעילות החלבון, הוספת קבוצת מתיל על גבי ה-DNA, לא נפגעה - בדיקה של רמות המתילציה בתאי נוק אאוט אלה, כלומר כמה קבוצות מתיל הוספו, העלתה שהן היו נורמליות. ייתכן ששני החצאים פעלו יחד, או שאחד משני החצאים פעל כמו החלבון הנורמלי השלם (ישנם תקדימים לכל אחת מהאפשרויות).

המנגנון השני שגילו החוקרים הוא מנגנון של "דילוג" מעל המוטציה בתהליך השחבור. רוב הגנים באדם עוברים תהליך שִחְבּוּר, שבו ה-RNA-השליח שנוצר עובר חיתוך ואז הדבקה של כמה מהחלקים החתוכים זה לזה, ואילו חלקים אחרים נגזרים החוצה. שחבור חלופי הוא מנגנון שמאפשר לחתוך ולחבר RNA מסוים בכמה דרכים שונות, על ידי "דילוג" על חלקים ממנו. ואכן, בכמה מתאי הנוק אאוט נמצא שהיה דילוג על הקטע שבו נמצאה המוטציה. לדוגמה, בתאי נוק אאוט לגן BRD3 נמצא שהיה דילוג על החלק שבו נמצאה המוטציה, אשר הכיל גם את קודון ההתחלה, והחלבון נוצר החל מקודון המתיונין הבא בהמשך החלבון, כך שהתקבל חלבון מקוצר.

הממצאים של הובר מעוררי דאגה, שכן הם מטילים ספק באלפי מחקרים שמשתמשים בקריספר לצורך יצירת נוק אאוט באמצעות מוטציית נונסנס. אם החלבון, או חלק ממנו, עדיין מתבטא בתאים, זה יכול לשנות את הפירוש לתוצאות של אותם מחקרים. 

המחקר של הובר אינו היחיד בנושא זה. מחקר שפורסם לפני חודשים אחדים בכתב העת Nature מצא שבמקרים שבהם מנגנון ה-NMD דווקא פועל בצורה טובה בתאי הנוק אאוט, מתרחשת לעתים הפעלה של גנים דומים לגן שיצא מכלל פעולה, אשר עשויים למלא את תפקידו. גם במקרה זה, הפירוש לתוצאות מחקרי נוק אאוט כאלה עשוי להיות שגוי במידת-מה.

המחקר של הובר, המחקר השני שצוין ומחקרים דומים להם מראים שהתאים מוצאים פתרונות מקוריים להתגבר על מוטציות שמייצרים המדענים, ואנו יכולים ללמוד מכך רבות על מנגנוני הבקרה התאיים, כמו גם על תהליכים אבולוציוניים. אולם מחקרים אלו משמשים גם אות אזהרה לחוקרים לבדוק בשבע עיניים כל שינוי שנערך בתאים, וגם את הפירוש שניתן לתוצאות הניסוי בעקבותיו. כי החיים, כאמור, תמיד ימצאו להם דרך.